یکی از پرکاربردترین دستگاههای تجزیه ای در ایران HPLC است. غالب افرادی که با این دستگاه در حال کار هستند می دانند که لحظات بسیار تلخ و شیرینی را می توان در کنار پمپ و ستون و اینجکتور و به خصوص با کروماتوگرام های تیز و گاهی پهن و دنباله دار آن دستگاه محترم ، داشت. به طوری که برخی مواقع از شدت شادی برای رفع شدن گرفتگی یا حل شدن مشکل پیک در پوست خود نمی گنجند و گاهی از شدت ناراحتی و اضطراب و هیجان در پوسته خود پنهان می شوند. همواره یک سوال مهم مطرح است آیا حال دستگاه HPLC من خوب است؟
آیا اینکه نتیجه نمیگیرم مقصر کیست ؟ محلول سازی ها - دستگاه - من - او - ما - شما - ایشان-
سایت ایران ناژو در یک مطلب جالب راه حل های عملی برای مشکلات این دستگاه ارائه داده است. بد نیست به آن سر بزنید
باز نشر این مطالب در این وبلاگ تنها جنبه آموزشی دارد و مانند سایت مقصد هدف کسب درآمد نیست.
مشکلات HPLC در یک پروسه آنالیز :
دریک سیستم HPLC ، عوامل زیادیمی توانند اشکال ایجاد کنند . در ابتدا باید مشکل را شناخت سپس به رفع آن اقدامورزید . با استفاده از جدول شماره 1 مشکل یا مشکلاتی را که درکروماتوگرامها ایجادمزاحمت می کنند مشخص کنید . بنابراین بایک پروسه حذفی شما قادر خواهید بود تا بصورت صحیح مشکل را رفع نمائید .
چگونهاز مزاحمت های فاز متحرک (M.ph) جلوگیری کنیم:
حساسیتپائین و بالابودن خط زمینه Baseline) ( ، اغتشاش یابرآمدگی روی کروماتوگرام ، غالبا می تواند مربوط به فاز متحرک باشد . آلودگی درفاز متحرک ممکن است باعث بالارفتن baseline شود و نادرستبودن پیک می تواند بعلت افزایش ناخالصی درفاز متحرک باشد .
آب می تواند بزرگترین منبع آلودگی در فاز متحرکباشد شما باید هنگام درست کردن فاز متحرک فقط از آب مقطر کاملا خالص یا یونیزه شدهاستفاده کنید . برای از بین بردن این آلودگی ها باید آب یونیزه شده را از میانزغال فعال شده یا یک غشاء C18 عبور داد .
تنهااز حلال ها ، نمک ها یا معرف های زوج یونی و ... که مخصوص HPLC هستند استفاده کنید. از حلال های باکیفیت پائین استفاده نکنید ، زیرا اثرات آلوده کننده ها غالبا باقی می ماند وزمانیکه شما از یک دتکتور با حساسیت بالا استفاده می کنید ، این اجزاء می توانندایجاد مزاحمت کنند . برای از بین بردن حباب ها در سیستم ، فاز متحرک را متناوباًگاززدائی نمائید . پس از آماده کردن فاز متحرک آنرا از فیلتر 0.45 یا 0.2 میکرون عبوردهید . این فیلتر ها علاوه بر گاززدائی باعث حذف ذراتی می شوند که عامل ایجاداغتشاش در baseline هستند .
درساخت فاز متحرک ، باید نسبت ها رعایت شود و باید کاملاً مطمئن شد که نسبت ها درستهستند و از حلالی استفاده کنید که حد واسط قطبیت را داشته باشد .
ازآنجائیکه بسیاری از بافرهای آبی باعث رشد باکتریها می شوند با تهیه محلولهای تازهمیتوان قویاً از رشد آنها جلوگیری بعمل آورد . با افزودن در حدود 100ppm از سدیم آزید (azid sodium) به محلول بافر آبی از رشد میکروارگانیسمها جلوگیری بعمل آورید . یا می توان این بافرها را با حلال هائی ماننداستونتیریل مخلوط کرد.
درهنگام استفاده از واکنشگرهای زوج یونی با دقت عمل کنید و باید بهترین غلظت و طولزنجیر این واکنشگرها برای هر آنالیز مشخص شود . معمولا افزایش غلظت یا افزایش طولزنجیر باعث افزایش زمان بازدارنده (retention time) می شود . پیشنهاد می کنیم از غلظتهای 0.2 تا 10mM استفاده کنید .
غلظتهایبالای (>50%) استونیتریل و دیگر حلال های آلی میتوانند باعث رسوب و اکنشگرهای زوج یونی شوند .
زمانیکهشما بخواهید از یک ترکیب برای بهبود آنالیز بعدی استفاده کنید اصلاح کننده هایفراری مانند تری اتیل آمین مفید هستند . این اصلاح کننده ها هم چنین به شما کمک میکنند تا از مشکلاتی که واکنشگرهای زوج یونی ایجاد می کنند اجتناب کنید . آنها رامی توان به بافرهای با غلظتهای 0.1% تا 1% اضافه کرد .افزایش غلظت آنها باعث بهبود شکل پیک درترکیبات پایه می شود اما می توانند باعثتغییر retention time شوند . اخیرا مطالعات نشان می دهد کهچرخش مداوم فاز متحرک مورد استفاده برای جداسازی باعث طولانی تر شدن عمر ستون می شود ولی باعث کاهش ارزش حلال میگردد. در این صورت شما باید کاهش تدریجیbaseline را که معمولا اتفاق می افتد ثبت کرده و در انتگرال گیری دخالتدهید . بخاطر داشته باشید در یک پروسهآنالیز اجزاء فرار بخار می شوند بخصوص زمانی که بطور متناوب گاززدائی می شوند واین امر ، ترکیب M.ph را تغییر میدهد .
مشکلات پمپ ها در جداسازی :
یکپمپ باید جریان ثابتی از حلال را در شرایط مختلف از ستون عبور دهد . پمپ های جدیدبه گونه ای طراحی شده اند که شامل سرنگ ،دیاگرام ، پیستون یا ترکیبی از آنها است .
مشکلاتپمپ ها معمولا آسان و قابل تصحیح هستند . برخی از آنها باعث بی نظمی در retention time ، اغتشاش روی base line یا شکافتگی روی کروماتوگرامها می شوند .اختلال در کار پمپ اثر ضعیفی روی کروماتوگرام دارد . یک نوع علامت نشتی این است کهنمک های موجود در محل اتصالات پمپ ، خود را نشان می دهند . وجود نشتی در پمپ ممکناست احتیاج به جابجایی قطعات در دستگاه داشته باشد . بعضی از اشکالات هم خاص دستگاه شما می باشد پس باید ازدستورالعمل رفع مشکلات استفاده نمائید .
محل تزریق (Injector) و حلال هایتزریق شده :
Injector بسرعت نمونه رابا کمترین flow وارد سیستم مینماید . در سیستم های HPLC نوع سرنگ ، Loop و fixedLoop می تواند متفاوت باشند . این مجموعه می تواند بصورت دستی ، باهوای فشرده یا الکتریکی باشد .
مشکلاتمکانیکی مربوط به injector (مانند چکهکردن ، نشتی یا ...) نسبتاً آسان و قابل تصحیح هستند . مشکلات دیگر که بر اثرافزایش تعداد تزریق ایجاد می شوند بیشتر مربوط به حلالیت است . علاوه بر اینهاگاهی اوقات می توان آنها را به خود injetor نسبت داد .
تغییردرارتفاع پیک ها ، شکافتگی پیک ها و پهن تر شدن پیک ها می تواند کاملا مربوط بهگرفتگی محل تزریق نمونه باشد .
بنابراینمخلوط نشدن کامل فاز متحرک با حلال و یا حلالیت کم نمونه در M.ph می تواند باعث گرفتگی محل تزریق شود .به عبارتی باید مطمئن شوید که قدرت شویندگی فاز متحرک بیشتر از حلال باشد (جدول3).
محافظتاز ستون :
اگرچهفیلتر کردن فاز متحرک ، همسو بودن فیلتر ها ، اشباع بودن ستون و گاردستون قسمتمهمی از دستگاه نیستند اما بخش بزرگی از مشکلات همراه با جداسازی را کاهش می دهند.
فیلترها و محافظ ستون از ورود ذرات به ستون جلوگیری می کنند و از تجمع ذرات درستون همقویاً جلوگیری می کنند . ذرات سیلیکا موجود در ساختار یک ستون ، درفاز متحرک حلنمی شود واز پایه سیلیکا موجود در ساختار ستون نیز محافظت می کنند .
عمرمفید این ذرات به فاکتورهای زیادی بستگی دارد که شامل ترکیب فاز متحرک ، خلوصنمونه ، PH و ...... دارد. بنابراین مجموع این عوامل می توانند باعث گرفتگی ذرات درستون ، کاهش فشار پمپ ،پهن شدن پیک ها یا شکافتگی در پیک شوند .
بدستآوردن اطلاعات بیشتر از ستون :
ستونهادر سایز ها و طرحهای مختلف طراحی شده اند . رنج وسیعی از پرکننده های ستون قابلدسترسی هستند که کاربرد همه آنها درنهایت ، جداسازی است . بیشترین وجه اشتراکمشکلات ایجاد شده در ستون مربوطه به زوال تدریجی آن است .
کاهش عمر مفید ستون باعث ضعیف شدن پیک ها ،شکافتگی پیک ها ، شانه دارشدن پیک ها ، کم شدن Resolution ، کاهش زمان بازدارنده و بالارفتن فشاربرگشتی (back pressure) است . این عوامل نشان دهنده آلودگی هایی هستند که در ستون جمع شده اندو باعث تغییر در فشردگی (Packing) آن شده اند .
اینآلودگی بیشترین تاثیر را در بازدهی ستونها می گذارند . بعنوان مثال بازدهی یک ستونبا فشردگی 3 میکرون به 0.5 میکرون کاهشپیدا می کند و فشردگی 5 تا10 میکرون به 2 میکرون یابیشتر کاهش پیدا می کند .
محافظتدرست از ستون و محلول سازی به روش صحیح باعث افزایش کارآیی بیشتر ستون می شود .تداخل و همپوشانی ذرات در یک ستون میتواند باعث تشکیل پیک های ضعیف و مشکلات دیگر شود . ظرفیت ستونها بستگی به عواملبسیاری دارد اما متداولترین آنها عبارتند از :
Analyltical Column
(25cm×4.6mm)<500µg
Semi-Preparative Column
(25cm×10mm)<100mg
Preparative column
(25cm×21.2mm)<500mg
مشکلاتمربوط به دتکتورها :
بیشتراز 20 نوع دتکتور در سیستمهای HPLC وجود دارد .متداولترین آنها ، فوتومترهای UV با طول موجهایمختلف و دتکتورهای refractiveindex هستند . دتکتورهای الکتروشیمی و هدایت سنجی هم عموعاً متداولند.پیشرفت در تکنولوژی سل دتکتورها ، استفاده از آنها را آسانتر کرده است .
مشکلاتدتکتور را می توان به دو دسته الکتریکی و مکانیکی - نوری تقسیم کرد . برای رفعمشکلات مربوط به بخش الکتریکی دتکتور ، باید با دستورالعمل دستگاه آشنا بود .مشکلات نوری یا مکانیکی معمولا به جریان سل مربوط می شود . مشکلات مربوط به دتکتورشامل نشتی ها ، حباب های هوا و آلودگیهای سل است . این عوامل معمولاً باعث ایجاداغتشاش روی خط زمینه کروماتوگرام می شوند .
بعضیاز مواد سل (خصوصاً در دتکتورهای (Refractive به فشارهایبالا حساس هستند . هرگاه سرعت فاز متحرک (flow rate) یا فشار معکوس (back pressure) از میزان ذکرشده در کاتولوگ دستگاه بیشتر باشد ، پنجره سل را خواهد شکست . لامپ های کهنه، باعثافزایش زمان ، کاهش حساسیت و کاهش ارتفاع پیک می شوند . اشتباه در وصل کابل هایبرگشتی نیز باعث بروز مشکلاتی می شود .
گرمکننده ستون ، ثبات
ایناجزاء بندرت برای سیستم ، مشکل ایجاد می کنند این موارد در جدول شماره 1 عنوان شدهاست .
صحتنتایج
همهمشکلات یک شبه پدیدار نمی شوند اما بتدریج توسعه پیدا می کنند . پس حفظ صحت نتایج. حیاتی است و بسیاری از مشکلات را حل می کند . ارزیابی کار هر ستون با شماست .زمانیکه قادر به ارزیابی بودید می توانید بطور صحیح مشکلات را حل کنید . شما میتوانید اطلاعات مربوط به تاریخچه بازدهی ستون ، فاز متحرک استفاده شده ، جریانلامپ ، کارپمپ و غیره ، را از مانیتور کامپیوتر سیستم تان دریافت کنید .
باکمک ثبات ها می توان از اشتباهات جلوگیری بعمل آورد . به عنوان مثال می توان مانعورود آب در داخل یک ستون سیلیکا یا رسوب کردن بافر در یک سیستم شد . بسیاری ازشیمیدانها سیستمهای HPLC را تغییر میدهند .
ثباتها بهترین روش برای نشان دادن تغییرات در سیستم هستند . برای مشکلات مربوط به پمپها ، دتکتورها ، Injector و اطلاعاتسیستم ، از این راهنما استفاده کنید .
فهرست مشکلات | |
شماره اشکال اشکال | شماره اشکال اشکال | شماره اشکال اشکال | |
| پیکها | 19 | شبه پیک ها | Baseline | |
16 | تغییرات درارتفاع | | انواع پیک های دفرمه شده | 12 | برآمدگی | |
15 | پهن شدن | |
14 | غیرعادی بودن –اغتشاش | |
2 | گم شدن پیک | 10 15 | ( (Frontingکاهش تفکیک پیک | |
13 | عادی بودن –اغتشاش | |
18 | منفی شدن | 7 | گردشدن | |
1 | عدم مشاهده پیک | 8,9 | شکافتگی دنباله دارشدن | | فشار پشت ستون | |
6 | عدم تفکیک پیک ها | |
5 | تغییرات زمان بازدارنده | 4 | بیشتر از حد معمول | |
17 | تغییرات حساسیت | 5 | کمتر از حد معمول | |
جدول 1-مشکلات HPLC و طریقه رفع اشکال |
رفع اشکال | علت اشکال | مشکل |
مشکل شماره 1 |
1-لامپ دتکتور را روشن کنید. 2-محل اتصالات و کابلها را چک کنید . 3-مشکل شماره 2 را ببینید . 4-باید مطمئن شوید که باندازه کافی، نمونه تزریق شده است . با یک محلول استاندارد تازه تهیه شده سیستم را ارزیابی کنید تا نمونه بعنوان منبع مشکل تأیید شود . 5-تنظیمات دستگاه را به گونه ای انجام دهید که ثبات قادر به رسم کروماتوگرام باشد. | 1-لامپ دتکتور خاموش است. 2-وجود نشتی یا شکستگی در لوله رابط بین دتکتور و محل تزریق یا دتکتور و ثبات . 3-عدم وجود جریان فاز متحرک . 4-نمونه ای وجود ندارد یا نمونه از بین رفته است . 5-وجود تنظیمات خیلی بالا روی دتکتور یا ثبات . | عدم مشاهده پیک / پیکهای خیلی کوچک. |
|
رفع اشکال | علت اشکال | مشکل |
مشکل شماره 2 |
1-پمپ را روشن کنید . 2-سطح فاز متحرک را در منبع کنترل کنید. جریان خروجی سیستم و محل تزریق نمونه را از نظر گرفتگی هوا کنترل کنید. اطمینان حاصل کنید که فیلتر خروجی فاز متحرک تمیز است . مطمئن شوید که اجزاء فاز متحرک کاملا گاززدائی شده است . 3-سیستم و پمپ را برای نشتی کنترل کنید زیرا پیک های موجود در محل نشتی اغتشاش های غیر معمول ایجاد می کنند . اگر لازم بود اتصالات پمپ را عوض کنید . 4-محل اتصال لوله به گارد ستون را اگر موجود است باز کنید . سرعت جریان فاز متحرک را کنترل کنید.پمپ را تحتFlow rote بالا حدود10ml/min ، Purgeکنید.در صورت لزوم پمپ ها را یکی یکی Purge کنید . اگر پمپ ها شیرخروجی هوا دارند ،هوا را از طریق آنها خارج کنید . اگر مشکل رفع نشد و هوا خارج نشد سیستم را با متانول100% بشوئید . اگر بازهم رفع نشد با کارخانه سازنده تماس بگیرید . | 1- خاموش بودن پمپ 2-اختلال در جریان –انسداد یا گرفتگی . 3-نشتی 4-به علت نوسانات فشار ، هوا در سر پمپ به دام افتاده است . | عدم وجود جریان . |
|
رفع اشکال | علت اشکال | مشکل |
مشکل شماره 3 |
1-سیستم را کنترل کنید.پمپ ها را برای نشتی ، وجود نمک و اغتشاشات غیر معمول چک کنید . اتصالات پمپ را اگر لازم بود تغییر دهید . 2-سطح فاز متحرک را در ظرف مخصوص آن کنترل کنید که بالای سطح فیلتر ها باشد . محل تزریق نمونه را برای مسدود شدن یا گرفتگی توسط حبابهای هوا چک کنید . اطمینان حاصل کنید که فیلتر داخلی فاز متحرک تمیز است و مطمئن شوید که اجزاء فاز متحرک کاملا با هم مخلوط و بطور صحیح گاززدائی شده است . 3-لوله محل اتصال را باز کنید و جریان فاز متحرک را کنترل کنید . اگر لازم باشد در flow rate بالا (10ml/min)پمپ را Purge کنید .اگر سیستم دارای شیرخروجی هوا است اجازه دهید هوا خارج شود . 4-دوباره ستون را وصل کنیدو flow rate حلال را روی 1-2ml/min قرار دهید . اگر فشار هنوز کم است نشتی ها را در محل اتصالات چک کنید. 5-ستون و محافظ آن را باز کرده و سیتم را Purge کنید . اگر مشکل رفع نشد با متانل 100% ، Purge کنید . 6-اتصالات را عوض کنید . | 1-نشتی 2-تداخل در جریان فاز متحرک مانند مسدود شدن 3-بدام افتادن هوا در سرپمپ (بعلت نوسانات فشار) 4-نشتی در انتهای اتصال ستون 5-هوا در مکانهایی از سیستم بدام افتاده است . 6-محل اتصالات در اطراف سرپمپ مسدود شده اند . | فشاری وجود ندارد یا فشار پائین تر از حد معمول است . |
|
رفع اشکال | علت اشکال | مشکل |
مشکل شماره 4 |
1-گارد را باز کنید و ستون را تحت فشار 2-5ml/min قرار دهید . اگر فشار کاهش یافت علت شماره 2 را بررسی کنید . در غیر اینصورت به صورت سیستماتیک با حذف یک به یک عوامل سیستم ، پی به علت افزایش فشار ببرید. برای کاهش فشار کار را با دتکتور شروع کنید . 2-گارد را عوض کنید (اگر ستون گارد داشته باشد)و فشار را چک کنید . در صورت لزوم دوباره گارد را سرجایش قرار دهید. اگر ستون بواسطه آنالیتیکی مسدود شده است ، ستون را برعکس کرده تا در ستون توازن برقرار شود . اگر باز مشکل باقی ماند ستون ممکن است قویا آلوده شده باشد . بنابر این از دستورالعمل مناسب استفاده کنید. (جدول 2 صفحه 19). اگر باز مشکل رفع نشد ورودی ستون را تغییر دهید یا ستون را عوض کنید. | 1- اشکال از پمپ – محل تزریق یا از لوله ها ست . 2-مسدود بودن گارد یا ستون | فشار بالاتر از حد معمول |
|
رفع اشکال | علت اشکال | مشکل |
مشکل شماره 5 |
1-اتصالات سیستم را کنترل کنید. پمپ را برای نشتی ها ،گرفتگی با نمک و اغتشاشات غیر معمول کنترل کنید . 2-فرمول ترکیب فاز متحرک را کنترل کنید. اگر فاز متحرک بصورت مکانیکی مخلوط می شود شما همان فاز متحرک را بصورت دستی مخلوط کنید . 3-هوا را از پمپ ها Purge کنید . یا از شیرهای خروجی استفاده کنید . اگر لازم شد اتصالات پمپ را عوض کنید . از گاززدائی فاز متحرک اطمینان حاصل کیند . 4-از ستون آون دار استفاده کنید (توجه داشته باشید که درجه حرارتهای بالاتر در ستون، بازدهی مؤثر را برای جداسازی کاهش می دهد . برای بدست آوردن بهترین نتیجه فاز متحرک را قبل از ورود به ستون می توان گرم کرد). 5-حجمهای کوچکتری را تزریق کنید (بعنوان مثال µli 10 نسبت به (100µliیا حجم نمونه را به نسبت 1:10 و1:100 رقیق کنید . 6-حلال را تنظیم کنید. اگرچه می توان از فاز متحرک هم بعنوان حلال نمونه استفاده کرد . 7-باید ستون جدیدی جایگزین ستون قبلی شود.اگر می توانید ستون قدیمی را احیاء کنید .(صفحه 19را ببینید). | 1-نشتی ها 2-تغییر در ترکیب اجزاء فاز متحرک (کوچکترین تغییرات در ترکیب اجزاء فاز متحرک می تواند باعث تغییرات زیادی در زمان بازدارنده شود ). 3-هوا در پمپ بدام افتاده است (در نتیجه زمان بازدارنده افزایش و کاهش می یابد ). 4-نوسانات درجه حرارت ستون ، باعث ایجاد این تغییرات می شود (خصوصاً در تبادلات سیستمهای تعویض یونی ). 5-افزایش بار ستون (درصورتیکه جرم محلول تزریق شده بالاتر از ظرفیت ستون باشد زمان بازدارنده معمولاً کاهش پیدا می کند ) . 6-حلال نمونه با فاز متحرک سازگار نیستند . 7-ستون مشکل دارد (نه بعنوان یک عامل عمده در بی نظمی زمان بازدارنده،بلکه با افزایش طول عمر ستون معمولا زمانهای بازدارنده کاهش می یابد ). | تغییرات در زمان های بازدارنده |
|
رفع اشکال | علت اشکال | مشکل |
مشکل شماره 6 |
1-فرآیند ساخت فاز متحرک را کنترل کنید (صفحه 2) . 2-گاردستون را اگر موجود است باز کنید و دوباره عمل آنالیز را شروع کنید . در صورت لزوم گارد ستون را دوباره قرار دهید . اگر ستون مسدود است آن را برگردانید و تراز کنید . اگر مشکل رفع نشد ستون باحتمال زیاد آلوده شده است پس از دستورالعمل مناسب استفاده کنید(جدول 2صفحه 19) اگر باز هم رفع نشد ستون را عوض کنید . | 1-آلودگی فاز متحرک یا تغییر کیفیت آن به مرور زمان باعث تغییر زمان بازدارنده می شود. 2-گارد یا ستون آنالیتیکی مسدود شده است . | عدم تفکیک پیک ها |
مشکل شماره 7 |
1-گاردستون را اگر موجود است بردارید و دوباره عمل آنالیز را شروع کنید . در صورت لزوم گارد ستون را عوض کنید . اگر ستون مسدود است آن را برگردانید و تراز کنید . اگر مشکل رفع نشد ستون باحتمال زیاد آلوده شده است.پس از دستورالعمل مناسب استفاده کنید(جدول 2صفحه 19) اگر باز هم رفع نشد ستون را عوض کنید . 2-حلال را تنظیم کنید . اگر چه می توان از فازمتحرک هم بعنوان حلال نمونه استفاده کرد . | 1-آلودگی روی گارد ستون یا حلقه ورودی ستون 2-حلال نمونه با فاز متحرک سازگار نیست . | شکافتگی در پیک ها |
|
رفع اشکال | علت اشکال | مشکل |
مشکل شماره 8 |
1-نحوه عملکرد ستون را با استاندارد ها کنترل کنید . 2-انواع دیگر ستون را امتحان کنید (بعنوان مثال ستون بی اثر یا خنثی برای ترکیبات پایه ) 3-PH را تنظیم کنید . معمولا برای ترکیبات پایه، بیشتر پیک های متقارن در PH پائین ایجاد می شوند. 4-واکنشگرهای زوج یونی یا اصلاح کننده های فرار اضافه کنید (صفحه 3) . | 1-تداخل درنمونه 2-اشتباه در تعیین نوع ستون 3-اشتباه در تعیین PH فاز متحرک 4-نمونه با سایت های فعال واکنش می دهد . | دنباله در ابتدا یا انتهای پیکها |
|
رفع اشکال | علت اشکال | مشکل |
مشکل شماره 9 |
1-نحوه عملکرد ستون را با استاندارد ها کنترل کنید . 2-ساخت فاز متحرک را کنترل کنید.(صفحه 2) 3-گارد ستون را اگر هست عوض کنید و دوباره آزمایش کنید. درصورت لزوم دوباره گارد ستون را بگذارید و اگر ستون عامل مشکل است از دستورالعمل مناسب استفاده کنید (جدول 2-صفحه19).اگر مشکل رفع نشد ستون را عوض کنید . | 1-تداخل در نمونه 2-آلودگی فاز متحرک یا تغییر کیفیت آن به مرور زمان 3-ستون یا گارد آلوده شده است یا کهنه شده است . | ایجاد دنباله در پیک هائی که قبلا متقارن بودند . |
|
رفع اشکال | علت اشکال | مشکل |
مشکل شماره 10 |
1-نحوه عملکرد ستون را با استاندارد ها کنترل کنید . 2-کارائی ستون را افزایش دهید یا حساسیت را اینقدر تغییر دهید تا تفکیک پیک ها از هم بهبود یابد . سعی کنید از نوعهای دیگر ستون هم استفاده کنید (مانند ستون غیرقطبیC18 تا ستونی با فاز قطبی سیا نو) . 3-حجمهای کوچکتر تزریق کنید (مانند10µli در مقابل 100µli )یا 1:10 نسبت به 1:100 از حجم نمونه . 4-حلال را تنظیم کنید. می توان نمونه ها را در فاز متحرک تزریق کرد . قطبیت پیوندها در فاز ساکن را با 200ml اتیل استات مخصوص HPLC تنظیم کنید(2.5ml/min) . سپس با حلالی با قطبیت حد واسط آنالیز را ادامه دهید . | 1-تداخل در نمونه 2-شانه دار شدن یا بالا آمدن تدریجی خط زمینه قبل از پیک اصلی ممکن است مربوط به اجزای دیگر نمونه باشد . 3-افزایش بار ستون 4-حلال نمونه با فاز متحرک تداخل دارد . | کاهش تفکیک پیک ها |
|
رفع اشکال | علت اشکال | مشکل |
مشکل شماره 11 |
1-حجم یا غلظت نمونه را کاهش دهید. 2-حساسیت را تنظیم کنید . 3-حجمهای کوچکتر از نمونه را تزریق کنید.(بعنوان مثال 10µli نسبت به100µi)یا به نسبت 1:10 و 10:100 از حجم نمونه را رقیق کنید . 4-قدرت بافر،PH یا ترکیب فاز متحرک را تغییر دهید . اگر لازم شد درجه حرارت ستون را بالا ببرید یا نوع ستون را عوض دهید (آنالیز ساختار محلول ممکن است نوع تداخلات را پیش بینی کند ). 5-ثابت ها را به گونه ای به پائینترین مقدار کاهش دهید تا در آنالیزهای بعدی مشکلی ایجاد نکنند . | 1-عملکرد دتکتورخارج از رنج خطی دینامیکی است . 2-حساسیت ثبات خیلی پائین است 3-بار ستون زیاد است . 4-تداخل بین ستون و نمونه 5-ثابت های زمانی دتکتور یا ثبات خیلی بالا است . | گردشدن پیکها |
مشکل شماره 12 |
1-درجه حرارت ستون و فازمتحرک را کنترل کنید . از آون حرارتی قبل از دتکتور استفاده کنید . 2-از حلال ها ، نمک های با درجه خلوص بالاو افزودنی های مخصوصHPLC استفاده کنید . فاز متحرک را قبل از استفاده گازدائی کنید .می توان از گاز هلیم هم برای گاززدائی استفاده کرد. 3- سل را با متانل یا حلالهای قوی دیگر متعادل کنید . اگر لازم شد سل را با HNO3 1N شستشو دهید . (هرگز باHCL این عمل را انجام ندهید). 4-مسیر مسدود شده را باز یا عوض کنید .به دستورالعمل دتکتور برای تعویض پنجره سل مراجعه کنید . 5-ترکیب فاز متحرک یا Flow rate را تصحیح کنید سعی کنید از مشکلات ساده مانند ترکیب فاز متحرک یا سرعت Flow rate اجنتاب کنید . 6-ستون را با یک حلال حدواسط قوی به تعادل برسانید ،سپس با 10الی 20حجم از فازمتحرک جدید ستون را قبل از شروع کار آماده آنالیز کنید . 7-مراحل ساخت فازمتحرک را کنترل کنید.(صفحه2) 8-از گاردستون استفاده کنید و اگر لازم شد ستون را با حلالهای قوی در فواصل بین شستشو متعادل کنید یا عمل آنالیز را متناوبا و دوره ای انجام دهید . 9-baseline را متوقف کنید . زمانی از مواد جدید استفاده کنید که رنج دینامیکی دتکتور اضافه شده باشد (صفحه 3) 10-ماکزیمم طول موج جذب UV را تغییر دهید . | 1-ایجاد نوسانات در درجه حرارت ستون (حتی کوچکترین تغییرات در درجه حرارت ستون باعث ایجاد این نوسانات می شود.غالبا بازتابش و هدایت دتکتور ها هم عامل ایجاد این نوسانات است ). 2-یکنواخت نبودن فاز متحرک (این حالت معمولا درجذب های بالا ایجاد می شود اما برآمدگی خط زمینه ترجیحا از نوسانات درجه حرارت است). 3-آلودگی یا وجود هوا در سل دتکتور . 4-مسدود شدن مسیر خروجی بعد از دتکتور باعث ترک برداشتن پنجره سل می شود در نتیجه درbaseline ایجاد اغتشاش می کند. 5-اشکالی در مخلوط کردن فازمتحرک بوجود آمده یا تغییر درFlow rate ایجاد شده است . 6-تعادل در ستون به آهستگی صورت می گیرد خصوصا زمانیکه فاز متحرک را تغییر می دهید . 7-فازمتحرک آلوده شده است ،یا تاریخ مصرف آن گذشته است یا برای ساخت آن از موادی با کیفیت پائین استفاده شده است . 8-اجزائی در نمونه که سرعت مهاجرت آنها در ستون کم است (k` بالا) باعث ایجاد پیکهای خیلی پهن در baseline می شود که بنظر می رسد baseline به سمت بالا کشیده می شود یا شکم داده است . 9-جریان فاز متحرک برقرار است. اما دتکتور تنظیم نیست . 10-دتکتور(UV) در ماکزیمم مقدار جذب تنظیم نیست اما در شیب منحنی قرار دارد . | برآمدگی baseline |
|
رفع اشکال | علت اشکال | مشکل |
مشکل شماره 13 |
1-فاز متحرک را گاززدائی کنید .سیستم را با خروج هوا از سل دتکتور یا پمپ به تعادل برسانید . 2-اتصالات سیستم را کنترل کنید . پمپ را برای نشتی ها ، گرفتگی با نمک کنترل کنید،که باعث اغتشاشات غیرمعمول می شود . اتصالات پمپ را اگر لازم شد عوض کنید . 3-فازمتحرک را با دست مخلوط کنید یا از حلال هایی با ویسکوزیته پائینتر استفاده کنید . 4-اختلاف دما را کاهش دهید یا تبادل حرارت را افزایش دهید . 5-در صورتیکه منبع مشکل،از خارج سیستم است LCو دتکتور و ثبات را یکی یکی جدا کنید . 6-نوسانات پمپ را به کمترین مقدار کاهش دهید . | 1-وجود هوا در فازمتحرک ، سل دتکتور یا پمپ 2-وجود نشتی در سیستم 3-فازمتحرک خوب مخلوط نشده است. 4-اثر درجه حرارت ( درجه حرارت ستون بالا است اما دتکتور گرم نیست). 5-تأثیر عملکرد دیگر وسایل الکترونیکی روی baseline 6-نوسانات پمپ | اغتشاش منظم در خط زمینه |
|
رفع اشکال | علت اشکال | مشکل |
مشکل شماره 14 |
1-سیستم را در قسمت اتصالات کنترل کنید .پمپ را برای نشتی ها ، گرفتگی با نمک و اغتشاشات غیرمعمول کنترل کنید . 2-ساخت فازمتحرک را کنترل کنید . (صفحه 2) . 3-دتکتور و ثبات را جدا کنید . برای رفع اشکال به دستورالعمل دستگاه مراجعه کنید . 4-سیستم را با حلال قوی به تعادل برسانید. 5-دتکتور را Purge کنید . یک وسیله برگشت فشار بعد از دتکتور نصب کنید . 6-سل را تمیز کنید . 7-لامپ را عوض کنید . 8-ستون را عوض کنید . | 1-نشتی 2-فازمتحرک آلوده شده است یا زمان مصرف آن گذشته است یا از موادی با کیفیت پائین ساخته شده است . 3-اشکال الکترونیکی در دتکتور یا ثبات 4-هوا در سیستم بدام افتاده است . 5-وجود حبابهای هوا در دتکتور 6-سل دتکتور آلوده شده است (حتی مقادیر بسیار کم آلودگی نیز میتواند باعث ایجاد اغتشاش شود ). 7-لامپ دتکتور ضعیف شده است . 8-ایجاد ترک در سیلیکای ستون یا مواد فشرده شده درون ستون | اغتشاش نامنظم baseline |
|
رفع اشکال | علت اشکال | مشکل |
مشکل شماره 15 |
1-فازمتحرک جدیدی درست کنید . 2-Flow rate را تنظیم کنید. 3-سیستم را در قسمت اتصالات کنترل کنید پمپ را برای نشتی ها گرفتگی با نمک و اغتشاشات غیرمعمول کنترل کنید . اگر لازم شد اتصالات پمپ را عوض کنید . 4-تنظیمات دتکتور را تصحیح کنید . 5- a: حجمهای کوچکتر را تزریق کنید (بعنوان مثال 10µli در مقابل 100µli )یا1:10 و 1:100 از حجم نمونه را رقیق کنید. b: زمان (t) را کاهش دهید یا از سل کوچکتر استفاده کنید . c: از اتصالات کوتاهتر یا از یک قطعه ID0.007-0.010 بطور تجربی استفاده کنید . d: زمان (t) را کاهش دهید . 6-غلظت بافر را افزایش دهید . 7-گارد ستون را عوض کنید . 8-ستون را با نوع جدید و مشابهی از آن عوض کنید . اگر ستون جدید پیک های متقارن داد پس ستون قدیمی را احیاء کنید (جدول 2 صفحه 19) . مجدداً آنالیز را شروع کنید . 9-خروجی انتهای ستون را باز کرده و فضای خالی را پر کنید .یا ستون را عوض کنید . 10-نوع ستون را عوض کنید تا جداسازی بهبود یابد . 11-درجه حرارت را افزایش دهید نباید بیشتر از 75ºc شود . مگر اینکه در مونوگراف ستون درجه حرارتهای بالاتر ذکر شده باشد . | 1-ترکیب فازمتحرک تغییر یافته است. 2-جریان فازمتحرک خیلی پائین است. 3-وجود نشتی(خصوصاً بین ستون و دتکتور) 4-نادرست بودن تنظیمات دتکتور 5- تأثیر عوامل بیرونی بر ستون a: اضافه بار ستون b: حجم سل یا زمان (t) در دتکتور خیلی بزرگ است . c: اتصالات بین ستون و دتکتور خیلی طولانی است یا ID خیلی بزرگ است . d: زمان (t) ثبات خیلی بالاست 6-غلظت بافر خیلی کم است . 7-گارد ستون آلوده یا کهنه شده است . 8-ستون آلوده یا کهنه است . 9-وجود فضای خالی در ورودی ستون 10- پیک بصورت دو یا چند پیک نسبتاً ضعیف نمایش داده می شود . 11-درجه حرارت ستون خیلی پائین است . | پهن شدگی پیک ها |
خواهشمنداست در صورت نیاز به اطلاعات بیشتر با شرکت ایران ناژو تماس حاصل فرمائید .
مترجم: فرحناز حدیدساز – کارشناس ارشد شیمی –مسئول آزمایشگاه شیمی
دکتر مریم شهیدی – مسوول فنی داروئی
